ABSTRACT
En la membrana laterobasal del epitelio del intestino delgado y del túbulo renal proximal han sido descrito dos mecanismos diferentes de transporte activo primario de Na+: (1) uno dependiente de K+, sensible a la ouabaina e insensible a la furosemida, correspondiente a la bomba de Na+/K+; y (2) otro independiente de K+, insensible a la ouabaina pero inhibida por furosemida, el cual es referido como la segunda bomba de sodio. De igual modo, dos actividades ATPásicas, dependientes de Mg2+, estimuladas por Na+ e inhibidas por vanadato, han sido descritas en esta membrana: (1) una dependiente de K+, sensible a la ouabaina e insensible a la furosemida, correspondiente a la ATPasa de Na+/K+; y (2) otra independiente de K+, insensible a la iuabaina pero inhibida por furosemida, la cual ha sido denominada como la ATPasa de Na+. Dadas las similitudes bioquímicas, se considera que la bomba de Na+/K+ y la segunda bomba de sodio están asociadas con las ATPasas de Na+/K+ y de Na+, respectivamente, como una entidad bioquímica única. No obstante, no había sido posible la separación óptima de ambas enzimas. Recientemente, se logró solubilizar ambas ATPasas utilizando un detergente no-iónico (C12E9), preservando sus actividades, y purificar la ATPasa de Na+ por selección negativa a través de una cromatografía de afinidad con Concanavalina-A-sefarosa. La ATPasa de Na+ esta constituida por dos subunidades: una subunidad alfa de 98 KDa y una subunidad beta de 50 KDa. La subunidad alfa fue parcialmente secuenciada por espectrometría de masa en serie, identificándose tres péptidos que están presentes en la subunidad alfa1 de la ATPasa de Na+/K+. La formación de intermediarios fosforilados durante el ciclo de reacción de la ATPasa de Na+, así como su dependencia de Mg2+ y sensibilidad a vanadato, identifican a esta enzima como integrante de las ATPasas tipo P.
Basolateral plasma membranes of small intestine and proximal renal tubule present two active Na+-transportmechanisms: (1) The Na+/K+-pump, which depends on K+, is inhibited by ouabain but insensitive to furosemide and (2) The Second sodium pump, which is K+-independent, insensitive to ouabain but inhibited by furosemide. Thse two transport mechanisms have been associated with two different Mg2+-dependent Na+-ATPases, inhibited by vanadate: (1) The K+-dependent Na+/K+-ATPase, sensitive to ouabain and insensitive to furosemide, and (2) The K+ independent, Na+-ATPase, which is inhibitable by furosemide and insensitiveto ouabain. There exist multiple biochemical and functional evidences indicating that these two ATPases are different but only recently it has been possible to identify the Na+-ATPase as a unique biochemical entity. Both ATPases can be solubilized in an active form using C12E9 as detergent and separated by exclusion chromatography in sepharose 6-B and affinity chromatography in concanavalinA-sepharose. The Na+-ATPase is constituted by two sub-units: an alpha subunit of 98 KDa and a beta subunit of 50 KDa. The alpha subunit was partially sequenced by Tandem Mass Spectrometry, evidenced three peptides that are also present in the alpha1 subunit of the Na+/K+-ATPase. Na+-ATPase is Mg2+-dependent, inhibited by vanadate and forms phosphorylated intermediate during its reaction cycle ATP, indicating that it si a P-type ATPase. These facts induced us to design degenerated primers against the most preserves motifs present in these ATPases and to intent the cloning of the Na+-ATPase. Thus, we identified a cDNA for a new P-type ATPase probably related with this enzyme.